線粒體蘋果酸脫氫酶(MDHm)樣本的前處理:
組織、細(xì)菌或細(xì)胞中胞漿蛋白與線粒體蛋白的分離:
1、 稱取約 0.1g 組織或收集 500 萬細(xì)胞,加入 1mL 試劑一和 10uL 試劑三,用冰浴勻漿器
或研缽勻漿。
2、 將勻漿 600g,4℃離心 5min。
3、 棄沉淀,將上清液移至另一離心管中,11000g,4℃離心 10min。
4、 上清液即胞漿提取物,可用于測(cè)定從線粒體泄漏的 α-KGDH(此步可選做)。
5、 在步驟④的沉淀中加入 200uL 試劑二和 2uL 試劑三,超聲波破碎(冰浴,功率 20%或
200W,超聲 3 秒,間隔 10 秒,重復(fù) 30 次),用于線粒體 α-KGDH 活性測(cè)定。
測(cè)定步驟
1、 分光光度計(jì)或酶標(biāo)儀預(yù)熱 30min 以上,調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至 340nm,蒸餾水調(diào)零。
2、 樣本測(cè)定
(1)在試劑五中加入 18mL 試劑四充分溶解,置于 37℃(哺乳動(dòng)物)或 25℃(其它物種)
水浴 10min;現(xiàn)配現(xiàn)用;
(2)在試劑六中加入 1mL 蒸餾水,充分溶解待用;現(xiàn)配現(xiàn)用;
(3)在微量石英比色皿或 96 孔板中加入 10μL 樣本、10μL 試劑六和 180μL 試劑五,混
勻,立即記錄 340nm 處 20s 時(shí)的吸光值 A1 和 2min20s 后的吸光值 A2,計(jì)算 ΔA=A2-A1。
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